Morfoanatomia da raiz de Arabidopsis thaliana submetida à cumarina (1,2- benzopirona)
Morphoanatomy in the root of Arabidopsis thaliana submitted to cumarine (1,2-benzopyran)
Morfanoanomía en la raíz de Arabidopsis thaliana presentada a cumarina (1,2-benzopirano)
Lívia Maria de Lima Santos1
Adenilson Henrique Gonçalves2
Resumo
Cumarinas podem alterar a germinação e o desenvolvimento das espécies receptoras, em ambientes naturais ou controlados. Objetivou-se identificar o efeito da cumarina na Germinação Total (GT (%), Velocidade Média da Germinação (S), Velocidade de Germinação Acumulada (AS) e Comprimento Total da Raiz (CTR), bem como o efeito cumulativo da cumarina sobre a morfoanatomia da raiz de Arabidopsis thaliana ao longo do tempo (7 e 14 dias). As sementes foram cultivadas em placas de Petri quadradas, contendo ágar e concentrações de cumarina compondo a curva dose-resposta (0; 1,5; 3,0; 6,0; 12 e 24 µM). A cumarina foi diluída previamente em etanol. Como controle, etanol acrescido ao ágar. Após determinar o IC50 (14 µM), sementes de A. thaliana foram cultivadas durante 7 e 14 dias. Posteriormente, foram realizados cortes (0,7 μm) dos ápices radiculares e corados com azul de toluidina. A inibição da germinação foi dose-dependente, ou seja, quanto maior a concentração de cumarina maior foi a inibição da germinação. Na maior concentração a germinação foi de 40%, AS e S foi de apenas 37% e o comprimento total das plântulas reduziu 66%. O IC50 induziu o espessamento do ápice radicular, principalmente aos 14 dias de cultivo, aumento de pelos radiculares, surgimento de raízes ectópicas e núcleos assimétricos nas celulas.
Palavras chave: Aleloquímico, Arabidopsis, curva dose-resposta, sistema radicular.
Abstract
Morphoanatomy in the root of Arabidopsis thaliana submitted to cumarine (1,2-benzopyran) Coumarins can alter the germination and development of recipient species, in natural or controlled environments. The objective was to identify the effect of coumarin on Total Germination (GT (%), Average Germination Speed (S), Accumulated Germination Speed (AS) and Total Root Length (CTR), as well as the cumulative effect of coumarin on the morphology of the Arabidopsis thaliana root over time (7 and 14 days) The seeds were grown in square Petri dishes, containing agar and concentrations of coumarin composing the dose-response curve (0; 1.5; 3.0; 6.0; 12 and 24 µM). Coumarin was previously diluted in ethanol. As a control, ethanol added to agar. After determining the IC50 (14 µM), A. thaliana seeds were grown for 7 and 14 days. Cuts (0.7 μm) of the root tips were performed and stained with toluidine blue. Germination inhibition was dose-dependent, that is, the higher the coumarin concentration, the greater the germination inhibition 40%, AS and S was only 37% and the total length of the seedlings them decreased by 66%. The IC50 induced thickening of the root apex, mainly at 14 days of cultivation, increased root hair, appearance of ectopic roots and asymmetric nuclei in the cells.
Keywords: Allelochemical, Arabidopsis, dose-response curve, root system.
Resumem
Morfanoanomía en la raíz de Arabidopsis thaliana presentada a cumarina (1,2-benzopirano). Las cumarinas pueden alterar la germinación y el desarrollo de las especies receptoras, en ambientes naturales o controlados. El objetivo fue identificar el efecto de la cumarina en la germinación total (GT (%), velocidad de germinación promedio (S), velocidad de germinación acumulada (AS) y longitud total de la raíz (CTR), así como el efecto acumulativo de la cumarina en la morfología de la raíz de Arabidopsis thaliana a lo largo del tiempo (7 y 14 días). Las semillas se cultivaron en placas de Petri cuadradas, que contenían agar y concentraciones de cumarina que componían la curva dosis-respuesta (0; 1.5; 3.0; 6, 0, 12 y 24 µM). La cumarina se diluyó previamente en etanol y, como control, se añadió etanol al agar. Después de determinar la IC50 (14 μM), las semillas de A. thaliana se cultivaron durante 7 y 14 días, con cortes (0.7 μm) en las puntas de las raíces, realizado y teñido con azul de toluidina, la inhibición de la germinación era dependiente de la dosis, es decir, cuanto mayor era la concentración de cumarina, mayor era la inhibición de la germinación 40%, AS y S eran solo 37% y la longitud total de las plántulas disminuyó 66%. El IC50 indujo el engrosamiento del ápice de la raíz, principalmente principalmente a los 14 días de crecimiento, aumento del vello radicular, aparición de raíces ectópicas y núcleos asimétricos en las células.
Palabras clave: Aleloquímico, Arabidopsis, curva dosis-respuestas, sistemas raíces.
INTRODUÇÃO
Cumarinas são lactonas do ácido hidroxicinâmico originárias da rota dos fenilpropanóides. São sintetizadas pela maioria das plantas superiores (MURRAY et al., 1982; OLIVEIRA et al, 2020) em tecidos foliares, sementes e frutos (ZOBEL e BROWN, 1995).
A cumarina (1,2 benzopirona) é o composto mais simples da classe e capaz de inibir o crescimento das plantas, alterar a respiração e a fotossíntese, afetar a atividade de enzimas responsáveis pelo metabolismo do nitrogênio e, ainda, alterar a morfologia de raízes (ABENAVOLI e FUGGI, 1995; BROWN, 1981; MORELAND e NOVITZKY, 1987; KUPIDLOWSKA et al., 1994).
A rizogênese, processo de formação da raiz, é afetada pela cumarina induzindo anormalidades a nível cromossômico, que se expressam em alterações na expansão radial do meristema da raiz (GRAÑA et al., 2017). O sistema radicular é central para a adaptação das plantas à heterogeneidade do solo e é organizado, principalmente, pela ramificação (TERUE et al., 2001). Sendo de fundamental importância o estudo e elucidação da atuação da cumarina sobre a morfologia raiz.
A resposta das plantas receptoras em relação à cumarina é específica e depende da concentração e do tempo de exposição (BENNETTE et al., 2004). O estudo publicado por KUPIDŁOWSKA (2001) relacionou a concentração e o tempo de exposição à cumarina, sobre A. thaliana, utilizando 500 µM durante 72 h. Já ABENAVOLI et al. (2008), obervaram o cultivo durante 12 dias utilizando 324 µM da cumarina. Apesar dessas evidências, não foram realizados estudos sobre a influência das concentrações de cumarina (1,2 – benzopirona), com vistas a identificar o IC50 capaz de produzir efeitos na morfologia da raiz na espécie modelo, Arabidopsis thaliana, ao longo do tempo. Desse modo, objetivou-se avaliar as respostas do efeito cumulativo (7 e 14 dias) da cumarina sobre a morfoanatomia da raiz de Arabidopsis thaliana.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal e condições de crescimento
Sementes de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Lehle Seeds, Texas USA), ecotipo Columbia (Col-0), foram esterilizadas em 50% de EtOH (3 min) e 0,5% de NaOH (3 min). Em seguida, as sementes foram lavadas três vezes em água destilada autoclavada. As sementes foram incorporadas em ágar 0,1%, e armazenadas á 4 °C durante 72 h para sincronizar a germinação das sementes. Em seguida, 24 sementes foram transferidas para cada placa de Petri quadrada (150 x 150 mm), totalizando 5 placas e 120 sementes por tratamento. As placas continham ágar 0,8% (p/v), 0,44% de macro e micronutrientes (p/v; Murashige- Skoog, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e 1% de sacarose; pH 6,0. Após o semeio as placas foram colocadas verticalmente em uma câmara de crescimento a 22 ± 2 °C e 55% de umidade relativa. A cumarina (1,2-benzopirona; 99%; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi preparado em 100µL de etanol P.A. (Sigma-Aldrich) e diluída no ágar para obter as concentrações testadas.
Curva de dose-resposta e aquisição de imagem
O meio de cultura suplementado com cumarina (0; 1,5; 3; 6; 12 e 24 μM) foi utilizado objetivando acompanhar o processo germinativo e o crescimento inicial da raiz, bem como os fenótipos após a exposição a cumarina. Foram utilizados cinco repetições por concentração com 24 sementes, cada. As plântulas foram cultivadas em fotoperíodo de 8 h (120 μmol m-² s-¹).
A taxa de germinação total [GT(%)], a velocidade média de germinação (S) e a velocidade de germinação acumulada (AS) foram calculadas de acordo com a metodologia de CHIAPUSIO et al. (1997). A curva dose-resposta do comprimento da raiz foi determinada após 14 dias da semeadura. Esse parâmetro também foi utilizado para deteminar o IC 50 da raiz (concentração de cumarina em µM necessária para reduzir 50 % do crescimento), por meio do programa GraphPad 7.3.
Após o período de cultivo, durante 7 e 14 dias, na presença do IC50 que corresponde 14 µM de cumarina e, na ausência da cumarina, 0 µM corresponendo ao controle. Após o período de cultivo, as raízes da A. thaliana foram analisadas e fotografadas, utilizando o microscópio Nikon Eclipse 800, equipado com uma câmera digital Nikon DS-U2 e um amplificador eletrônico Nikon SMZ 1500 (Melville, NY, EUA) (Nikon, Japão).
Análise da estrutura das raízes da Arabidopsis thaliana
Os ápices das raízes de A. thaliana, cultivadas durante 7 e 14 dias na presença de 0 µM e do IC50 da cumarina, foram fixados em 0,5% de glutaraldeído preparado em tampão de cacodilato a 0,1 M e pH 7,2, e incubadas à temperatura ambiente durante 2 h. Após três lavagens, em tampão de cacodilato, os ápices foram transferidos para 2% de tetróxido de ósmio (OsO4), também preparado em tampão de cacodilato a 0,1 M e pH 7,2, incubado durante 3 h. Em seguida, foram transferidos e mantidos em solução a 10% de acetona com 2% de acetato de uranilo por 1 h. Após esse tempo, amostras foram desidratados em concentrações crescentes de acetona: 50% (2 × 30 min), 75% (2 × 1 h), 80% (2 × 1 h), 95% (2 × 1 h) e 100% (2 × 2 h); e depois incorporado na resina de Spurr (DÍAZ-TIELAS et al., 2012).
As seções longitudinais com espessura de 0,7 μm foram coradas com azul de toluidina e observadas em Microscópio de luz Eclipse 800, equipado com uma câmera digital Nikon DS-U2 com o software NIS-Elements D2’30 SP1.
RESULTADOS
Conforme a curva dose-resposta (Tabela 1) de A. thaliana, a partir da concentração 6 µM observou-se inibição significativa do crescimento refletindo noo comprimento total da raiz (CTR), que reduziram 40% em relação ao controle (Tabela 1). Entretanto, as reduções foram maiores nas concentrações de 12 e 24 µM, apresentando-se 54 e 56% menores, repectivamente (Tabela 1). De maneira geral, os parâmetros analisados a espécie vegetal se comportou conforme a curva dose-dependente, ou seja, à medida que a concentração aumentou maior foi a redução dos parâmetros analisados até a concentração 12 µM, onde foi observada a estabilização da curva, atingindo um platô.
Tabela 1. Germinação total [GT (%)], Velocidade média da germinação (S), Velocidade de germinação acumulada (AS) e Comprimento total da raiz (CTR) da A. thaliana submetidas às concentrações de cumarina (0-24µM). N = 120.
|
GT (%) |
S |
AS |
CTR |
|
|
0 µM |
100a |
100a |
100a |
100a |
|
1,5 µM |
81b |
92b |
94b |
117b |
|
3,0 µM |
70c |
74c |
81c |
83c |
|
6,0 µM |
60c |
67d |
64d |
56d |
|
12 µM |
41d |
46e |
46e |
46e |
|
24 µM |
40d |
37e |
37e |
44e |
|
C.V.(%) |
14 |
17 |
20 |
8 |
Legenda: Letras diferentes indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos, p <0,05 (teste Tukey) C.V. = coeficiente de variação. N = 120.
A morfologia geral das plântulas e das raízes de A. thaliana cultivadas em meio a cumarina 1,2-benzopirona (0; 1,5; 3; 612 e 24 µM) durante 14 dias (Figura 2), foram diferentes conforme a concentração utilizada. As plântulas do controle apresentaram crescimento adequado das raízes (Tabela 1 – CTR) e a estrutura tecidual foi organizada ao longo do eixo de crescimento (Figura 2A). A partir da concentração de 3 μM da cumarina as plântulas apresentaram crescimento irregular e desenvolvimento de grande quantidade pelos ao longo da raiz (Figura 2C 2D, 2E, 2F). Algumas plântulas demonstraram espessamento do ápice radícular (Figura 2E) e na presença de 24μM de cumarina às raizes desenvolveram bifurcação do ápice radicular (Figura 2F). A partir do emprego da curva dose-resposta foi determindado o IC50 da cumarina, ou seja, refere-se à concentração da cumarina que inibiu 50% a GT (%), S, AS e o CTR em A. thaliana. O valor do IC50 foi de 14μM.
Figura 2. Plântulas da A. thaliana submetidas às concentrações da curva dose- resposta durante 14 dias e fotoperíodo de 8 h. As imagens foram capturadas em microscópico eletrônico com amplificador e mostram às plântulas crescendo em placas de Petri quadrados (parte superior da imagem) e as imagens inferiories mostram às raízes das plântulas. A) Controle; B) Concentração 1,5µM de cumarina; C) Concentração 3,0 µM de cumarina; D) Concentração 6,0µM de cumarina; E) Concentração 12µM de cumarina; F) Concentração 24µM de cumarina. Escala: 500 mm
Sementes de A. thaliana foram cultivadas com a concentração do IC50 (14 μM), durante 7 e 14 dias. As raízes das plântulas do controle e as cultivadas durante 7 dias apresentaram estrutura típica, com linhas longitudinais de células simétricas e pelos somente na zona pilífera. As plântulas tratadas com IC50 da cumarina, durante 14 dias, apresentaram desenvolvimento de grande quantidade de pelos (Figura 3E) e o aparecimento de raiz ectópico (Figura 3F).
Figura 3. Plântulas de A. thaliana cultivadas em meio à concentração de 14 µM (IC50) da cumarina, durante 7 e 14 dias. Controle (a) - zona pilífera; (b) - ápice radicular; Plântula com sete dias de cultivo com a concentração do IC50 (c) - zona pilífera, (d) - ápice radicular; Plântula de catorze dias de cultivo com a concentração do IC50 (e) - ápice radicular, (f) - zona pilífera destaque região de bifurcação da raiz. Escala: 500µm.
Fonte: Do autor (2018).
As seções semifinas (0,7 μm) analisadas por meio da microscopia óptica demonstraram que às raízes das plântulas do controle possuíam células retangulares, núcleos redondos e isodiamétricos todos em posição central (Figura 4A). Bem como, as raízes tratadas durante 7 dias com a cumarina (Figura 4B), quando comparadas ao controle.
Em se tratando das raízes cultivadas durante 14 dias algumas anormalidades foram observadas (Figura 4C), principalmente as células da zona de crescimento que apresentaram estrutura desorganizada, espessamento da região subapical da raiz, células com tamanhos e formas irregulares, núcleos alongados e/ou amorfos (Figura 4C).
Figura 4. Microscopia de luz (20x) de seções longitudinais semifinas de ápices de raízes de Arabidopsis thaliana coloridas com azul de toluidina. (A) Controle, (B) Plântula de 7 dias de idade tratada com IC50 da cumarina 1,2-benzopirona, (C) Plântula de 14 dias tratada com IC50 da cumarina. n-núcleo, na-núcleo assimétrico, ca- célula assimétrica, mar - meristema apical da raiz.
Fonte: Do autor (2018)
DISCUSSÃO
No presente estudo, a aplicação exógena da cumarina (1,2- benzopirona) sobre Arabidopsis thaliana afetou a germinação e levou a redução do crescimento radicular primário, produção de grande quantidade pelos radiculares, raiz ectópica e desorganização tecidual.
A inibição da germinação da espécie A. thaliana pela cumarina foi rápida, aparentemente irreversível e cumulativa, à medida que se aumentou a concentração da cumarina. Esses resultados corroboram com os estudos realizados por Aliotta et al. (1992, 1994) e Abenavoli. O principal mecanismo observado pelos mesmos autores está associado à inibição da captação de água na fase I e II da curva de embebição.
Diante dos resultados percebe-se que a cumarina é uma substância com múltiplos alvos fisiológicos e que seus efeitos podem ser estimulantes em baixas concentrações, como foi observado no crescimento primário da raiz e inibidor em altas concentrações (JANSSON e SVENSSON, 1980).
A cumarina induziu o aumento da área transversal da raiz de A. thaliana, principalmente na região subapical. Fato esse que poderia ter sido causado por uma alteração na produção e/ou distribuição da auxina ao longo do corpo da planta (GOREN e TOMER, 1971).
O IC50 encontrado no presente estudo (14 µM) está muito abaixo do obervado por Abenavoli et al., (2008) de 324 µM e por Kupidłowska (2001) 500 µM para inibir 50% do crescimento da raiz de A. thaliana, isso pode indicar a maior sensibilidade do ecótipo utilizado no presente estudo. Os danos fitotóxicos apresentados pelas plântulas de Arabidopsis, após o tratamento com a 1,2-benzopirona, foram superiores aos observados por GRAÑA et al. (2017) ao utilizar a escopoletina, um tipo de cumarina, com maior inibição da germinação e do comprimento da raiz. Com base nos dados disponíveis, confirma-se a natureza fitotóxica do IC50 da cumarina encontrado com base da curva dose-resposta, sendo efetiva na indução das mudanças na estrutura da raiz e, como tal, merece investigações aprofundadas.
CONCLUSÃO
O IC50 da cumarina foi de 14 µM com fortes danos fitotóxicos aos 14 dias de cultivo, apresentando redução do crescimento radicular, aumento da formação de raízes ectópicas e do número de pelos radiculares; células e núcleos assimétricos em raízes de A. thaliana.
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